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如何通过DNA分子大小判断细胞来源?

【前言】近些年,无论是癌症患者血浆中的游离DNA,还是孕妇血浆中的胎儿DNA,都在分子诊断中产生了令人惊喜的应用。在这些应用中,血浆中的DNA统称为循环游离DNA(cfDNA),如何对其进行分析,决定着在不同临床环境中分子诊断的不同结果。f0

香港中文大学卢煜明教授近期在《Trendsin Genetics》发表了一篇综述,就血浆cfDNA谱的分析技术进行了深入探讨。该综述重点围绕cfDNA的大小分布展开,具体罗列了cfDNA大小特征的检测方法,并探讨了cfDNA谱的潜在诊断应用,该应用的原理在于利用不同种类的cfDNA大小之间的差异,发展以大小为基础的分子诊断,例如:

应用1:在妊娠妇女血浆中,来自胎儿的DNA碎片平均短于母体的;

应用2:在癌症患者血浆中,来自肿瘤细胞的DNA碎片平均短于非肿瘤细胞的。

【鉴定cfDNA片段大小的方法】

①凝胶电泳法 cfDNA电泳的条带在电泳图中,可以看cfDNA大小谱系显示180bp核小体蛋白的整数(1~5×)倍数,不过电泳在区分和定量上仍有局限性。

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②qPCR 运用qPCR来检测cfDNA谱主要是通过运用跨越感兴趣的目标区域的不同大小的扩增片段来实施。下图中可以看出,abcd是不同大小的DNA片段,其对应的qPCR检出量具有差异性,大片段相对于小片段的比例可以转化成DNA完整性指数。这一原则已经应用在区分胎儿和母体的片段大小,还应用于区分肿瘤和非肿瘤来源的cfDNA。但是,这个方法只能用于已知的位点,而不能用于全基因组范围的分析。

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③显微镜 电子显微镜和原子力显微镜可以用于观察DNA分子的构象,并测量分子长度。我们知道,cfDNA的长度可以由1bp等于0.34nm的假设折算,因而通过测量分子长度,能够获得cfDNA的碱基数。然而这个方法需要精密的工作,耗时且通量低。
④大规模平行测序 大规模平行测序技术的出现使得数百万甚至上亿的cfDNA分子大小的检测成为可能,这个检测通常是使用下图所示的末端配对测序的方法进行。和凝胶电泳及位点特异性PCR相比,大规模平行测序允许在基因组范围和在单个碱基水平对cfDNA进行精细分析。

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【cfDNA的来源】

凋亡是产生cfDNA的重要机制。研究显示血浆中的cfDNA可以有很多因素产生,比如怀孕、癌症、肝移植、骨髓移植和系统性红斑狼疮等,通常由DNA短片段组成。最近,大规模平行测序的结果显示,血浆DNA在166bp有显著的峰,另外有一系列每10bp等间隔的小峰,如143bp的峰。这些发现表明了cfDNA分子是由凋亡过程中的DNA酶分解产生的,而以10bp进行分解的现象,则是由于核小体的DNA包裹在酶切反应中起到了重要作用。

那么,对于两种重要的cfDNA,胎儿DNA和肿瘤DNA,使用测序的方法,究竟如何进行检测?

①源于怀孕的DNA分子: 早期qPCR的结果显示,母亲血浆中源于怀孕的DNA分子要比母亲的背景DNA短。而胎儿和母体DNA最显著的差异是166bp的峰相对地减少,并且143bp等较小的峰相对地增加。通过母体和胎儿DNA之间大小的差异,可用于检测胎儿染色体非整倍数,如下图所示。研究发现较小尺寸的cfDNA似乎与较低水平的DNA甲基化相关,这种现象可能在塑造cfDNA片段的大小中起了重要的作用。

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②肿瘤来源的DNA: 运用qPCR分析我们可以发现在癌症患者中较长的DNA的比例较多,而往往在抗癌治疗后,较长的DNA比例会有所下降,如果持续原本的比例,则意味着较差的预后。但是,如果分析肿瘤相关的突变位点,结果却是肿瘤来源的cfDNA比正常组织的要短。

这种从qPCR法得出的不同结果似乎难以调和。在2015年,有一项研究试图调和这些明显矛盾的结果,如下图所示,用大规模平行测序对癌症患者血浆中的DNA进行分析。尽管癌症特异性突变的检测提供了一种基因型的方法来区分肿瘤与非肿瘤细胞DNA,但只有有限数量的癌症具有特异性的突变。大规模平行测序的分析显示,在肝癌患者血浆中cfDNA具有显著的166bp的峰及一系列以10bp为周期逐渐减小的峰,这种现象和在怀孕妇女和器官移植的受体病人中类似。也就是说,血浆中肿瘤DNA的量越大,低于150bp的短DNA片段比例越高。

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【应用前景】

cfDNA在新一代的分子诊断中有着广泛的应用前景,从癌症测试到无创产前检查都有涉及。其中一个成功例子是无创产前检测在全球的快速普及。对于第一代无创产前检测而言,胎儿染色体非整倍体检测是基于分子计数的原理。而这篇综述对血浆DNA的生物学认知将带来基于分子大小检测的新方法。

(来源:生物探索)

本文固定链接: http://blog.fungenomics.com/2016/06/how-to-determine-the-cell-type-by-the-size-of-dna-molecular.html | Genomics for fun

该日志由 解螺旋的矿工 于2016年06月11日发表在 测序技术, 癌症基因组 分类下, 你可以发表评论,并在保留原文地址及作者的情况下引用到你的网站或博客。
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如何通过DNA分子大小判断细胞来源?:目前有1 条留言

  1. 沙发
    HRD:

    您好,可否将这篇介绍相关的文献告知一下呢?

    2016-11-03 09:42 [回复]

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